HEK293.clover sejtvonal
A HEK293.clover sejtvonalat arra hoztuk létre, hogy a TTTN PAM szekvenciával rendelkező Cas12a nukleázok hasítási hatékonyságát is tudjuk vizsgálni nagyszámú targeten disruption assay-vel. A módosított clover szekvencia a humán prion fehérje ATG-je után került beillesztésre a HEK293 sejtek (293 H, Gibco) genomjába egy önhasító donor plazmiddal, NHEJ-knock-in segítségével.
Módosított clover szekvencia
Három egymást követő timidint vagy adenint sárgával, illetve kékkel jelöltünk.
Disruption assay
A sejteket egy nappal a transzfekció előtt 48 lyukú lemezekre helyeztük, körülbelül 25 000-30 000 sejt/lyuk sűrűséggel. A sejteket kétféle plazmiddal együtt transzfektáltuk: Cas12a variáns expressziós plazmiddal (137 ng) és crRNS és mCherry kódoló plazmiddal (97 ng), 48 lyukú lemezeken, lyukanként 1 µl Turbofect reagenssel. A transzfektált sejteket hat nappal a transzfekció után áramlási citometriával elemeztük. Kontrollként egy inaktív LbCas12a nukleázt expresszáló vektort használtunk. A nukleázok bontó aktivitását a következőképpen számoltuk ki:
1 – (minta GFP % / negatív kontrollok átlagos GFP %-a).
A transzfekciós hatékonyságot az mCherry-t expresszáló sejtek segítségével számoltuk ki. A transzfekciókat három példányban végeztük.
Referencia
Tóth, Eszter ; Varga, Éva ; Kulcsár, Péter István ; Kocsis-Jutka, Virág ; Krausz, Sarah Laura ; Nyeste, Antal ; Welker, Zsombor ; Huszár, Krisztina ; Ligeti, Zoltán ; Tálas, András ; Welker, Ervin
Improved LbCas12a variants with altered PAM specificities further broaden the genome targeting range of Cas12a nucleases
NUCLEIC ACIDS RESEARCH 48 : 7 pp. 3722-3733. , 12 p. (2020)