GFxFP – Welker Lab

GFxFP riporter rendszer

A GFxFP riporter rendszer Cas nukleázok hasítási hatékonyságának meghatározására és összehasonlítására alkalmas. A GFxFP riporter rendszer előnye, hogy genomi kontextustól függetlenül vizsgálható benne az egyes targetek hasítási hatékonysága. Alatta bal oldalt ábra, jobb oldalán a magyarázat: „A GFxFP riportervizsgálat elvének vázlata. A két GFP fél szekvenciája zölddel van jelölve. Mindegyik tartalmaz egy nem átfedő szegmenst (zöld) és egy átfedő szegmenst (zöld szürke vonalakkal). Az expressziós kazettát egy CAG promóter hajtja (fehér nyíl), és egy SV40 (Simian Vacuolating Virus 40) polyA jel (pA, szürke doboz) zárja le. A GFP első felének expresszióját egy korai STOP kodon (fekete jel) zárja le, és így nem eredményez kimutatható zöld fluoreszcenciát. A második GFP-fél sem Kozak-szekvenciát, sem ATG-t nem tartalmaz. A célhelyen (kék doboz) történő nukleáz hasítás után a keletkezett kettősszálú DNS-törés az átfedő homológ szekvenciák HDR segítségével javítható. Így egy intakt GFP szekvencia jön létre, amelyből egy funkcionális fluoreszcens GFP (zöld) íródik át.

Példa: A különböző LbCas12a variánsok hasítási hatékonyságának összehasonlítása ugyanazon a célponton különböző PAM-szekvenciákkal a plazmid alapú GFxFP-tesztben egér N2a sejtekben.
A különböző nukleázok hatására a háttérszint felett számolt GFP pozitív sejtek százalékos aránya. A hibasávok a 3 független transzfekcióban mért százalékos arányok átlagát ± standard eltérést mutatják.

Transzfekciós részletek
A sejtek egy nappal a transzfekció előtt 3×104 sejt/well sűrűséggel 48 lyukú lemezekre kerültek. A következő napon, kb. 40%-os konfluencia mellett a sejteket Turbofect reagenssel transzfektáltuk plazmid konstrukciókkal, röviden a következőképpen: 250 ng teljes plazmid DNS-t (2 ng GFxFP plazmid, 124 ng crRNS és nukleáz expressziós plazmid, valamint 124 ng mCherry expressziós plazmid a transzfekció hatékonyságának monitorozására) és 1 μL Turbofect-et 50 μL szérummentes DMEM-ben kevertünk össze, majd a keveréket 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, mielőtt a sejtekhez adtuk volna. Minden mintából három párhuzamos transzfekciót végeztünk. A sejteket két nappal a transzfekció után áramlási citometriával elemeztük. Az EGFP jelet az mCherry pozitív populációban elemeztük. A háttér-fluoreszcenciát egy crRNS nélküli, inaktív LbCas12a nukleáz expressziós vektor negatív kontrollként történő felhasználásával határoztuk meg, és ezt a háttérértéket minden mintából kivontuk. Minden esetben három párhuzamos transzfekciót végeztünk.

Addgene szám: #89052
A célszekvencia elhelyezésére szolgáló klónozási hely a BamHI és EcoRI helyek között van.

Referenciák
Tóth, Eszter ; Weinhardt, Nóra ; Bencsura, Petra ; Huszár, Krisztina ; Kulcsár, Péter István ; Tálas, András ; Fodor, Elfrieda ; Welker, Ervin
Cpf1 nucleases demonstrate robust activity to induce DNA modification by exploiting homology directed repair pathways in mammalian cells
BIOLOGY DIRECT 11 Paper: 46 , 14 p. (2016)

Tóth, Eszter ; Czene, Bernadett C ; Kulcsár, Péter István ; Krausz, Sarah Laura ; Tálas, András ; Nyeste, Antal ; Varga, Éva ; Huszár, Krisztina ; Weinhardt, Nóra ; Ligeti, Zoltán ; Borsy, Adrienn Éva ; Fodor, Elfrieda ; Welker, Ervin
Mb- and FnCpf1 nucleases are active in mammalian cells: activities and PAM preferences of four wild-type Cpf1 nucleases and of their altered PAM specificity variants
NUCLEIC ACIDS RESEARCH 46 : 19 pp. 10272-10285. , 14 p. (2018)

Tóth, Eszter ; Varga, Éva ; Kulcsár, Péter István ; Kocsis-Jutka, Virág ; Krausz, Sarah Laura ; Nyeste, Antal ; Welker, Zsombor ; Huszár, Krisztina ; Ligeti, Zoltán ; Tálas, András ; Welker, Ervin
Improved LbCas12a variants with altered PAM specificities further broaden the genome targeting range of Cas12a nucleases
NUCLEIC ACIDS RESEARCH 48 : 7 pp. 3722-3733. , 12 p. (2020)